凍干技術在外泌體存儲中的應用

一、什么是外泌體？

外泌體(Exosomes)是細胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一種，大小在30-

150nm，由細胞內(nèi)的多泡小體(Multivesicular bodies,MVB)與細胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細胞外，廣泛存在于細胞培養(yǎng)上清以及各種體液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。

二、外泌體的常規(guī)存儲條件有哪些？

      實驗室中常規(guī)的外泌體存儲條件一般是4℃、-20℃、-80℃。在一項研究中[1]，研究者評估了儲存在4℃，-20℃和-80℃下長達28天的外泌體的穩(wěn)定性，并將其與新鮮的外泌體進行了比較。研究者發(fā)現(xiàn)，與新鮮分離的外泌體相比，不同的存儲溫度和存儲時間會影響外泌體的穩(wěn)定性、大小分布和顆粒數(shù)量（Fig.1），并影響了外泌體的細胞吸收和生物分布（Fig.2）。對于功能性研究，根據(jù)研究設計建議對新鮮分離的外泌體進行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是對于長期保存用于治療應用的外泌體，-80℃存儲條件將是更可取的。

      外泌體作為治療試劑或藥物遞送載體有廣泛的應用前景，但外泌體存儲在-80°C將不利于其運輸及應用，因此還需要其他存儲方法。凍干是一種已用于保存多種類型的生物材料（蛋白質，血漿、活細胞等）的技術。此外，凍干技術已被用于改善藥物遞送載體脂質體的長期穩(wěn)定性。因此，凍干技術有可能改善外泌體的保存穩(wěn)定性，如果凍干的外泌體可以在室溫條件下穩(wěn)定保存，外泌體的應用范圍則將會大大提升。

Fig.1   不同存儲條件和不同存儲時間下外泌體的NTA檢測結果（下圖）

Fig.2 不同儲存條件下外泌體的細胞吸收（下圖）

三、凍干技術在外泌體存儲中的嘗試

      2016年Johnny等人從膠質瘤患者腦脊液中分離的外泌體，溶解于PBS緩沖液后進行凍干，外泌體凍干粉在室溫中存放了7天后，發(fā)現(xiàn)外泌體顆粒數(shù)減少了37–43% [2]；2018年Elia等人在間充質干細胞外泌體中試生產(chǎn)中使用了凍干技術，并針對凍干的外泌體進行了理化檢測[3]；2018年Chonlada等人通過海藻糖作為凍存保護劑進行黑色素瘤外泌體凍干，在25℃條件下可以穩(wěn)定保存4周時間[4]. 2019年Khairat等人使用海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮40（PVP40）作為干細胞外泌體的凍存保護劑，摸索兩者之間的不同比例來尋找合適的保護劑[7]；

四、外泌體常用的凍存保護劑有哪些？

      4.1 海藻糖 trehalose

      海藻糖是蘑菇、蝦、昆蟲和細菌中所含的一種天然的非還原性的二糖。海藻糖被食品和化妝品工業(yè)廣泛用作構造劑，穩(wěn)定劑或保濕劑，并用作不穩(wěn)定蛋白藥物，疫苗和脂質體以及用于移植的細胞和器官的（低溫）防腐劑。多項毒性研究確定了口服，胃或腸胃外給藥后海藻糖在小鼠和人類中的安全性和耐受性。海藻糖為多種生物物質提供保護作用，包括穩(wěn)定蛋白質，細胞膜和脂質體，減少冷凍過程中細胞內(nèi)冰形成以及防止蛋白質聚集的能力[4，5, 7]。

      4.2 甘露醇mannitol

      化學式為C6H14O6，是一種糖醇，是山梨糖醇的同分異構體，易溶于水，為白色結晶性粉末，有類似蔗糖的甜味，常用的凍存保護劑。甘露醇不僅可作為優(yōu)良的骨架劑使用，而且在一些處方中它能夠兼作蛋白質的凍干保護劑。甘露醇對蛋白質的保護作用與其濃度、形態(tài)結構有關，而其濃度與結晶形態(tài)有時呈一定的關聯(lián)性。通常認為無定型甘露醇具有使蛋白質穩(wěn)定的作用而結晶態(tài)的甘露醇則失去保護功能；1%或更低濃度的甘露醇通過無定型結構的形成而阻止蛋白質藥物的聚集，但是高濃度的甘露醇則易于形成結晶態(tài)而促進蛋白質藥物的聚集[3，6]。

五、展望

      外泌體凍干技術將極大地促進其藥物開發(fā)，凍干外泌體保留了生物活性，不需要昂貴的冷鏈或其他復雜的存儲條件。此外，將來需要對含外泌體的核酸（例如miRNA）進行更詳細的評估，并探討凍干對其穩(wěn)定性的影響。 外泌體-RNA不僅對于細胞反應的傳遞很重要，而且對于將外泌體用于診斷環(huán)境也很重要。 評估更詳細的凍干外泌體如何與其靶組織相互作用也很重要。

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