凍干技術(shù)在外泌體存儲(chǔ)中的應(yīng)用

一、什么是外泌體？

外泌體(Exosomes)是細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一種，大小在30-

150nm，由細(xì)胞內(nèi)的多泡小體(Multivesicular bodies,MVB)與細(xì)胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細(xì)胞外，廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。

二、外泌體的常規(guī)存儲(chǔ)條件有哪些？

      實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)的外泌體存儲(chǔ)條件一般是4℃、-20℃、-80℃。在一項(xiàng)研究中[1]，研究者評(píng)估了儲(chǔ)存在4℃，-20℃和-80℃下長(zhǎng)達(dá)28天的外泌體的穩(wěn)定性，并將其與新鮮的外泌體進(jìn)行了比較。研究者發(fā)現(xiàn)，與新鮮分離的外泌體相比，不同的存儲(chǔ)溫度和存儲(chǔ)時(shí)間會(huì)影響外泌體的穩(wěn)定性、大小分布和顆粒數(shù)量（Fig.1），并影響了外泌體的細(xì)胞吸收和生物分布（Fig.2）。對(duì)于功能性研究，根據(jù)研究設(shè)計(jì)建議對(duì)新鮮分離的外泌體進(jìn)行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是對(duì)于長(zhǎng)期保存用于治療應(yīng)用的外泌體，-80℃存儲(chǔ)條件將是更可取的。

      外泌體作為治療試劑或藥物遞送載體有廣泛的應(yīng)用前景，但外泌體存儲(chǔ)在-80°C將不利于其運(yùn)輸及應(yīng)用，因此還需要其他存儲(chǔ)方法。凍干是一種已用于保存多種類型的生物材料（蛋白質(zhì)，血漿、活細(xì)胞等）的技術(shù)。此外，凍干技術(shù)已被用于改善藥物遞送載體脂質(zhì)體的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。因此，凍干技術(shù)有可能改善外泌體的保存穩(wěn)定性，如果凍干的外泌體可以在室溫條件下穩(wěn)定保存，外泌體的應(yīng)用范圍則將會(huì)大大提升。

Fig.1   不同存儲(chǔ)條件和不同存儲(chǔ)時(shí)間下外泌體的NTA檢測(cè)結(jié)果（下圖）

Fig.2 不同儲(chǔ)存條件下外泌體的細(xì)胞吸收（下圖）

三、凍干技術(shù)在外泌體存儲(chǔ)中的嘗試

      2016年Johnny等人從膠質(zhì)瘤患者腦脊液中分離的外泌體，溶解于PBS緩沖液后進(jìn)行凍干，外泌體凍干粉在室溫中存放了7天后，發(fā)現(xiàn)外泌體顆粒數(shù)減少了37–43% [2]；2018年Elia等人在間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中試生產(chǎn)中使用了凍干技術(shù)，并針對(duì)凍干的外泌體進(jìn)行了理化檢測(cè)[3]；2018年Chonlada等人通過(guò)海藻糖作為凍存保護(hù)劑進(jìn)行黑色素瘤外泌體凍干，在25℃條件下可以穩(wěn)定保存4周時(shí)間[4]. 2019年Khairat等人使用海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮40（PVP40）作為干細(xì)胞外泌體的凍存保護(hù)劑，摸索兩者之間的不同比例來(lái)尋找合適的保護(hù)劑[7]；

四、外泌體常用的凍存保護(hù)劑有哪些？

      4.1 海藻糖 trehalose

      海藻糖是蘑菇、蝦、昆蟲和細(xì)菌中所含的一種天然的非還原性的二糖。海藻糖被食品和化妝品工業(yè)廣泛用作構(gòu)造劑，穩(wěn)定劑或保濕劑，并用作不穩(wěn)定蛋白藥物，疫苗和脂質(zhì)體以及用于移植的細(xì)胞和器官的（低溫）防腐劑。多項(xiàng)毒性研究確定了口服，胃或腸胃外給藥后海藻糖在小鼠和人類中的安全性和耐受性。海藻糖為多種生物物質(zhì)提供保護(hù)作用，包括穩(wěn)定蛋白質(zhì)，細(xì)胞膜和脂質(zhì)體，減少冷凍過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)冰形成以及防止蛋白質(zhì)聚集的能力[4，5, 7]。

      4.2 甘露醇mannitol

      化學(xué)式為C6H14O6，是一種糖醇，是山梨糖醇的同分異構(gòu)體，易溶于水，為白色結(jié)晶性粉末，有類似蔗糖的甜味，常用的凍存保護(hù)劑。甘露醇不僅可作為優(yōu)良的骨架劑使用，而且在一些處方中它能夠兼作蛋白質(zhì)的凍干保護(hù)劑。甘露醇對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用與其濃度、形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而其濃度與結(jié)晶形態(tài)有時(shí)呈一定的關(guān)聯(lián)性。通常認(rèn)為無(wú)定型甘露醇具有使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的作用而結(jié)晶態(tài)的甘露醇則失去保護(hù)功能；1%或更低濃度的甘露醇通過(guò)無(wú)定型結(jié)構(gòu)的形成而阻止蛋白質(zhì)藥物的聚集，但是高濃度的甘露醇則易于形成結(jié)晶態(tài)而促進(jìn)蛋白質(zhì)藥物的聚集[3，6]。

五、展望

      外泌體凍干技術(shù)將極大地促進(jìn)其藥物開發(fā)，凍干外泌體保留了生物活性，不需要昂貴的冷鏈或其他復(fù)雜的存儲(chǔ)條件。此外，將來(lái)需要對(duì)含外泌體的核酸（例如miRNA）進(jìn)行更詳細(xì)的評(píng)估，并探討凍干對(duì)其穩(wěn)定性的影響。 外泌體-RNA不僅對(duì)于細(xì)胞反應(yīng)的傳遞很重要，而且對(duì)于將外泌體用于診斷環(huán)境也很重要。 評(píng)估更詳細(xì)的凍干外泌體如何與其靶組織相互作用也很重要。

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